固氮菌肥料行业标准

点击次数:   更新时间:2020-11-25 17:26     来源:365竞猜

  本标准规定了固氮菌肥料产品的分类、技术要求、检验方法、检验规则、包装、标识、运输、贮存等。

  本标准适用于含有益的固氮菌、能在土壤和多种作物根际中固定空气中的氮气,供作物氮素营养,又能分泌激素刺激作物生长的活体制品。本标准也适用于以固氮菌为主的含有能促进固氮、生长的植物促生根际细菌(PGPR)的复合固氮菌肥料。

  下列标准所包含的条文,通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时,所示版本均为有效。所有标准都会被修订,使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。

  在土壤里能固定空气中的氮,供作物氮素营养,又能分泌激素刺激作物生长的微生物。

  既依赖根际环境生长,又在根际中固定空气中的氮气,对作物的生长发育产生积极作用的微生物。

  固氮菌每消耗1g碳水化合物(糖)从空气中摄取氮素的毫克数,固氮效能用mg氮/g糖表示。

  42按菌种及特性分为自生固氮菌肥料、根际联合固氮菌肥料、复合固氮菌肥料。

  在含一种有机碳源的无氮培养基中能固定分子氮,并具有一定的固氮效能。菌体一般为短杆状(固氮螺菌属菌体呈螺旋状),革兰氏染色阴性。

  可用下列菌种固氮螺旋菌(Azospirillum);阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)经鉴定为非致病菌的菌株;粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)经鉴定为非致病菌的菌株;肺炎克氏杆菌(Klebsiellapneumoniae)经鉴定为非致病菌的菌株。

  使用本准则规定之外的菌种生产固氮菌肥料时,菌种必须经过鉴定,并符合51要求。

  生产固氮微生物肥料所使用的菌种,必要时还要进行菌种染色鉴别(见附录B)和菌种固氮效能测定(见附录C)。

  按每一发酵罐菌液制成的产品为一批,逐批抽样检验。抽样过程要严格避免杂菌污染。

  抽样前预先准备好无菌塑料袋(或塑料瓶)、金属勺、剪刀、封口机、牛皮纸封样袋、标签、抽样封条和胶水。

  在成品库抽样,可按形分层设点抽取,抽样以件为单位,小包装产品以一包装箱为一件。大包装(30!50kg)产品以一袋(或一桶)为一件。抽样件数由样品基数的大小确定。1!10件,全部抽样;11!200件,抽样10件;201!400件,抽取20件;样品基数大于

  每件包装产品抽取一小袋,在无菌条件下每袋取样200g。然后将所有样品混匀,按四分法缩到2000g,分装4袋,然后封口。每2袋为一份装入牛皮纸封样袋。

  液体产品每件吸取10mL,一同放入无菌的三角瓶中,混匀后分成两份,每份250mL。冻干产品,每件取一支放入无菌的三角瓶中,加无菌液体培养液,溶解混匀后分成两份,每

  生物显微镜(10100);菌落计数器;恒温培养箱;恒温干燥箱,恒温摇床;灭菌锅;无菌室或超净工作台;酸度计;试管%15mm150mm,%18mm180mm;培养皿直径9cm;三角瓶500mL;无菌吸管05、1、5、10mL;玻璃刮刀;滤纸;酒精灯;标准筛孔径018mm和015mm;1号羊毛画笔;无菌水;无离子水。712试剂选择培养基(见附录A);刚果红染液(05%)。

  将固体固氮菌肥料包装打开,装在白色搪瓷盘中,将液体固氮菌肥料摇匀,在明亮光线pH值测定

  液体固氮菌肥料的pH值测定:取供检菌液直接测定pH值,取三次测定结果的平均数。固体固氮菌肥料的pH值测定:取50mL烧杯一个,加入菌肥25g,无离子水25mL。通过磁力搅拌器使溶液均匀后用酸度计测定pH值。取三次测定结果的平均数。

  称取固体固氮菌肥三份,每份2000g,精确到001g,放入已称恒重的铝盒中。置105干燥箱内烘烤4h,移至干燥器内,冷却后称重。根据烘干前后质量差按式(1)计算含水量。取三个样品测定数的平均值。平行样品绝对偏差应低于1%。

  (精确至001g),置于标准筛中(直径分别为018mm或015mm),用水冲洗,用毛笔轻刷,至粉末不再通过为止。将筛余物置105!110温度下烘干,称重。筛余物百分含量按式(2)计算:

  采样应不少于500g,从中称取1000g,加入带玻璃珠的100mL的无菌水中(液体菌剂取10mL,加入90mL的无菌水中),静置20min后在旋转式摇床上200r/min充分振荡

  用无菌吸管吸取5mL上述母液的菌悬液加入45mL无菌水中,混匀成110稀释的菌悬液,这样依次稀释,分别得到11102,11103,11104,11105等浓度(每个稀释度必须更换无菌吸管)。

  用05mL无菌吸管分别吸取不同稀释度菌悬液01mL,加至直径为9cm平皿的选择培养基(见附录A)表面,用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀地涂于琼脂表面,或取1mL不同稀释度菌悬液加入培养皿内,与琼脂培养基混匀,每个样品取3个连续适宜稀释度,每一稀释度重复3次,同时加无菌水的空白对照。28培养2!3d后每个稀释度取5!10个菌落的菌体,涂片染色(见附录B)。显微镜观察识别后,选一个适宜稀释度(菌落在30!300个之间的平板),计算出同一稀释度三个平皿上菌落平均数。

  杂菌数是指在选择培养基上,除有效活菌外的其他菌的菌落数与马丁培养基上霉菌数之和。马丁培养基10-4稀释度菌悬液加样,操作步骤同样品有效活菌数检测操作。

  加样量(mL)……………………………………………………………………………(4)

  727有效期检验在产品说明书标明的有效期到达前10d测定扰品各项指标,方法同721!726。

  b)产品有效活菌数符合指标,杂菌率不符合指标,但小于本标准规定的两倍时(液体10%、固体30%、冻干瓶4%),而且在马丁培养基平板上霉菌数小于30105,其他指标有一项不符合,也可判为合格产品;

  C产品有效活菌数及杂菌率符合指标,在水分、外观、pH值、细度等次要检测项目中,有3项不符合技术指标,也判为合格产品。

  a)产品有效活菌数不符合技术指标或投入菌种没有完全相应的检验出,判为不合格产品;

  b)产品杂菌率超过本标准规定的两倍(液体10%、固体30%、冻干瓶4%),判为不合格产品;

  c)产品有效活菌数符合指标,杂菌率不符合指标,但小于本标准规定的两倍时C液体10%、固体30%、冻干瓶4%),其他指标有两项不符合指标,判为不合格产品;

  e)产品水分、pH值、细度、外观等次要检测项目中,有4项不符合技术指标,判为不合格产品。

  833含有植物促生根际细菌(PGPR)的固氮菌肥料产品检测时,只测固氮菌数量,不测

  液体肥料小包装用塑料瓶或玻璃瓶,大包装用塑料桶。固体肥料用不透明聚乙烯塑料袋包装。冻干菌剂用玻璃指形管线外包装

  外包装采用纸箱,纸箱质量应符合GB/T6543的要求。箱外用尼龙打包带加固。

  913每箱(袋)产品中附有产品合格证和使用说明书,在使用说明中标明使用方法、用量及注意事项。

  在包装箱(袋)上印有产品名称、商标、标准编号、肥料登记证号、生产单位、厂址、生产日期、批号和净重,并印有防晒、防潮、防冻等标记,若有必要还要加印易碎、防倒置等标记。内包装上有产品名称、商标、标准编号、肥料登记证号、有效菌含量、生产日期、有效期、产品性能、使用说明书及生产单位、厂址等。

  适用于常用运输工具,运输过程中有遮盖物,防止雨淋、日晒及35以上高温。气温低于0时采取保温措施,防止菌肥冻冰。运输过程中轻装轻卸,避免包装破损。

  产品贮存在阴凉、干燥、通风的库房内,最适温度为10!25,不得露天堆放,以防雨淋和日晒,避免冻冰及长时间35以上高温。

  a)将碱性复红在研钵中研磨后,逐渐加入95%酒精,继续研磨使之溶解,配成甲液。

  c)把甲液和乙液混合摇匀,成为石碳酸复红,通常可将混合液稀释5!10倍使用。

  B222加孔雀绿染液3!5滴于涂片处,酒精灯火焰加热至冒汽,但不沸腾,并随时补加

  B224用005%碱性复红染色1min,水洗,镜检(若005%碱性复红浓度太高,可根据

  先用少量(3!5mL)蒸馏水溶解碘化钾,再投入碘片,待碘全溶后,加水100mL,配成母

  待硝酸银溶解后,取出10mL备用,其余的90mL硝酸银液中滴加浓氢氧化铵,则形成很浓厚的沉淀,再继续滴加氢氧化铵到刚刚溶解沉淀成为澄清溶液为止。再将备用的硝酸银慢慢滴人,则出现薄雾,但轻轻摇动后,薄雾状的沉淀又消失,再滴入硝酸银,直到摇动后,仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止(如雾重,则银盐沉淀出,不宜使用)。

  421涂片:在载玻片的一端滴一滴蒸馏水,用接种环挑取斜面上少许菌苔,在载玻片的水滴中轻蘸几下。将玻片稍倾斜,使菌液随水滴缓慢流到另一端,然后平放在空气中干燥B422涂片干燥后,滴加甲液染3!5min,用蒸馏水冲洗。加乙液染30!60s,并在酒精灯上加热,使其稍冒蒸气而染液不干,然后用蒸馏水冲洗,干后镜检。

  在500mL三角瓶中加入100mL无氮培养基(含糖1%即1g),121灭菌30min。无菌操作,每瓶接入两环待测菌种(或1mL培养3d的培养液),放置摇床上振荡(120r/min)

  糖类遇硫酸即脱水成为醛类,再变成呋喃衍生物,后者与蒽酮缩合,生成蓝绿色化合物。于580!650nm处进行比色测定(蒽酮可与单糖、双糖、淀粉、糊精等反应),该方法适

  C12202%(m/V)蒽酮溶液:称取02g蒽酮于100mL硫酸中。充分搅拌,使其溶解。

  C123葡萄糖标准液:准确称取葡萄糖1000g,溶于水中,定容至1000mL,即为

  取发酵培养的菌液100!400mL(取决于含糖量),稀释至10000ml,取此稀释液100mL于比色管中,加水至200mL,每管加入蒽酮试剂400mL,摇匀,水浴加热15min,使之充分显色,冷却后,于580!650nm处进行比色测定,记录吸光度,同时进行空白试验。

  吸取1.00mL放入比色管中,加水至2.00mL,按C1.3.1方法测定,记录吸光度用标准系列的含糖量定义横坐标,吸光度为纵坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线mL溶液的含糖量(X)按式(C1)计算:

  在硫酸铜或硫酸钾存在下,浓硫酸中加入菌液,并加热使试样全部有机氮转化为氨态氮,与奈氏试剂反应,于波长420nm处进行比色测定。

  C22550%(m/V)酒石酸钾钠溶液:50g酒石酸钾钠溶于100mL水中。

  C226奈氏试剂:71g碘化钾,10g碘化汞(HgI2)溶于少量水中,另配16g氢氧化钠溶于

  70mL水中,冷却后将前一溶液缓缓倒入氢氧化钠溶液中,边加边搅拌,最后用水稀释至100mL,静置过夜,取清液储于棕色瓶中。

  C227催化剂:1000g硫酸钾与100g硫酸铜共同研磨均匀,储于广口瓶中。

  吸取固氮菌液100mL于30mL消化管中,加硫酸(C221)3mL,加01g催化剂(C227)和5滴双氧水(C222)消煮至清亮,若反应液久煮不清,可冷却后加1!2滴双氧水(C222),继续煮至无色透明,取下冷却。加少许蒸馏水,摇匀,滴加40%氢氧化钠至出现氢氧化铜沉淀(约11!12mL),加酒石酸钾钠(C225)20滴,以去除氢氧化物沉淀掩蔽钙镁,将试管液全部转移至100mL容量瓶中,消化管洗涤液一并倒入容量瓶,稀释至刻度,摇匀。过滤,滤液1000mL于比色管中,加氢氧化钠(C223)100mL,加酒石酸钾钠100mL,加奈氏试剂3mL,摇匀,显色2!3min后,即倒入比色杯中,于420nm处比色计测定。读取吸光度。

  准确称取在(1055)烘1h直至恒重的优级纯试剂硫酸铵04716g,溶于水,稀释至

  用标准液的氮含量为横坐标,相应的吸光度为纵坐标,绘制工作曲线分析结果的计算

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